Окраска дрожжей метиленовым синим инструкция

Метиленовый синий и другие красители в микроскопии

Как приготовить образец для изучения в микроскопе?

Для изучения микроорганизмов производят микроскопирование как живых, так и убитых микробов в неокрашенном и окрашенном виде.

Микроскопический препарат готовят на предметном стекле. Предметные стекла должны быть кристально чисты и абсолютно обезжирены. На поверхности обезжиренного стекла вода легко расплывается и не образует капель шаровидной формы.

Новые стекла перед употреблением кипятят в 1%-ном растворе соды 10 минут, промывают водой, слабой соляной кислотой и хорошо прополаскивают в дистиллированной воде.
Дочерние и родовые шрамы на поверхности дрожжевых клеток.

Стекла после исследования надо обработать раствором серной кислоты в течение 2 часов, хорошо промыть в воде и прокипятить 10 минут в 4%-ном растворе соды. Ополоснутые затем дистиллированной водой стекла протирают чистой полотняной тканью.

Хранить предметные стекла лучше всего в банке с притертой пробкой, погруженными в смесь спирта с эфиром, взятых в равных объемах. Из банки предметные стекла достают пинцетом.

Покровные стекла — тонкие стеклышки (толщиной 0,15-0,17 мм) размерами обычно 18х18 мм, 20х20 мм, 18х24 мм. Ими накрывают препарат на предметном стекле для изучения.

Как приготовить раствор метиленового синего

Физиологический раствор натрия хлорида с метиленовым синим: метиленовый синий 0,1 г; физиологический раствор натрия хлорида -100,0 мл. Отвешивают указанное выше количество метиленового синего и помещают его в чистую бутылку. Прибавляют физиологический раствор натрия хлорида и тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов краски. Для работы фильтруют небольшое количество раствора краски в капельницу.

Техника приготовления краски из сухого порошка. Некоторое количество порошка малахитового зеленого или метиленового синего растирают пестиком в чистой сухой ступке. Отвешивают 3 г порошка краски, насыпают его в бутылку и прибавляют дистиллированную воду, чтобы получилось 100 мл раствора. Для приготовления рабочего раствора наливают 1 мл одного из полученных выше 3%-х водных растворов краски в бутылочку емкостью 250 мл. Прибавляют 100 мл глицерина и 100 мл дистиллированной воды; перед использованием раствор тщательно перемешивают.

Где взять метиленовый синий?

Коврик, скальпель, метиленовый синий.
Если у вас домашний микроскоп, возникает вопрос, где брать препараты?

Всё очень просто: этот препарат продаётся в магазинах, он используется в аквариумистике. Смотрите на фото. Также для приготовления препаратов для микроскопа пригодится скальпель и коврик для резки (безопасный, вы не будете царапать под ним стол, он самовосстанавливающийся).

На фото — коврик для резки, скальпель и бутылочка метиленового синего. Всё приобретено в самом обычном (не специализированном) интернет-магазине.

Исследование микроорганизмов в живом виде

Плесневые грибы и дрожжи лучше рассматривать в живом виде в препарате «раздавленная капля». Клетки этих микроорганизмов относительно крупные, обычно при микроскопировании в живом виде хорошо выявляются их форма, размеры, детали внутреннего строения, характер размножения (почкование, деление, спорообразование и т.д.).

Бактерии чаще рассматривают в мертвом виде на фиксированных окрашенных препаратах (из-за их малого размера). При этом мы получаем более ясное представление о форме и размерах клеток, о способности их к спорообразованию.

В живом виде в «раздавленной капле» бактерии рассматривают в том случае, когда выясняют их способность к движению.

При микроскопировании дрожжей в каплю жидкости на стекле добавляют петлей небольшое количество метиленовой сини (до голубого окрашивания) и эту смесь тщательно размешивают. Окраска живых дрожжей метиленовой синью применяется для того, чтобы выявить мертвые клетки, легко окрашивающиеся в синий цвет. Живые клетки остаются неокрашенными, так как не пропускают краску через свою оболочку.

Приготовленный на предметном стекле препарат дрожжей накрывают покровным стеклом и рассматривают с объективом 40Х. В таком препарате обычно хорошо видны прозрачные овальные или круглые клетки дрожжей с ядрами и оболочками, которые хорошо заметны в клетках живых дрожжей. Мертвые клетки, как правило, более мелкие по сравнению с живыми и окрашены в синий цвет.

Окраска дрожжей метиленовым синим

Наибольшее распространение получил метод выявления мертвых клеток с помощью метиленового синего. После попадания в клеточную цитоплазму под действием ферментов редуктаз этот краситель восстанавливается живыми дрожжевыми клетками до бесцветных соединений. Мертвые клетки окрашиваются в синий цвет. Эффективность данного метода зависит не только от состояния клеточной мембраны, но и от активности оксидоредуктаз в клетке.

Окраска клеток метиленовым синим и сафранином

Более полную информацию о физиологическом состоянии дрожжей дает окрашивание фиксированных препаратов метиленовым синим, танином и сафранином. Сафранин применяется для выявления клеточных ядер, которые окрашиваются в красный цвет. Если клетки живые и содержат оксидоредуктазы, расщепляющие метиленовый синий, то окрашенный препарат приобретает красноватый, а не фиолетовой оттенок.

Реактивы: краситель метиленовый синий; краситель сафранин; 5 %-й раствор танина в воде; физиологический раствор (0,9 %-й раствор NaCl).

Нанести каплю суспензии дрожжей на обезжиренное мылом предметное стекло. Оставить высыхать на воздухе при комнатной температуре. После высыхания капли зафиксировать препарат (10 раз провести стеклом в пламени спиртовки). Нагревать несильно, не пережигать. Залить стекло раствором метиленового синего и выдержать в течение 4 минут при комнатной температуре. Смыть краситель теплой водой. Залить стекло свежеприготовленным раствором танина на 2 минуты. Смыть краситель под струей воды. Залить на 16 минут стекло раствором сафронина. Смыть краситель. Микроскопирование следует проводить нефлюоресцирующим маслом при увеличении 400х.

Препарат живых бактерий

Препарат живых бактерий готовится подобно препарату дрожжей, но бактерии можно рассматривать и без добавления краски. Препарат рассматривается с иммерсионным объективом 90 X, лучше всего в затемненном поле (т.е. с прикрытой диафрагмой). Если культура бактерий подвижная, то хорошо видны быстрые разнохарактерные движения отдельных клеток.
Морфология голодных и старых клеток (фотоувеличение 400х).

Для приготовления препарата плесневых грибов очень осторожно (чтобы не разрушить органов спороношения) специальной иглой (можно препаровальной) или ботаническим пинцетом снимают кусочек пленки гриба и переносят его в каплю воды, предварительно нанесенную на предметное стекло. Препарат осторожно, слегка придавливая, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом с объективом 8Х. При этом увеличении хорошо различается строение органов спороношения плесневых грибов. Для подробного изучения отдельных деталей строения (гиф, сумок и т.д.) препарат рассматривают с объективом 40X.

При приготовлении препаратов в раздавленной капле нужно помнить :

1. При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться его ребром к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить стекло.

2. Капля не должна быть большой, чтобы жидкость не переливалась за края и не попадала на верхнюю сторону покровного стекла. Избыток воды снимите фильтровальной бумагой.

3. Одиночные пузырьки воздуха, оставшиеся под покровным стеклом, обычно не мешают наблюдению. Но если их много, препарат лучше приготовить заново.

4. Препарат не должен быть слишком густым, чтобы микроорганизмы не заслоняли друг друга.

5. Приготовленные препараты рассматривают тут же после приготовления (особенно живых бактерий), так как в иначе вода высыхает и клетки бактерий теряют подвижность.

6. Бактериологическую петлю (или иглу) перед каждым очередным пассажем и после него (нанесение капли воды на стекло, снятие культуры с агара и ее размешивание, взятие краски и т.д.) следует обязательно докрасна прокаливать в пламени горелки. После прокаливания петлю быстро охлаждают на воздухе (держат 2-3 секунды, ни к чему не прикасаясь) и приступают к выполнению очередного этапа работы.

Морфологическая модель клетки.

Простая окраска препаратов

При простой окраске препаратов на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо красящего раствора (метиленового синего, разведенного фуксина и прочее). Для получения более чистых препаратов рекомендуется красящий раствор наливать на отрезок фильтровальной бумаги, которой покрывают мазок.

Раствор краски в среднем выдерживают на мазке 2-3 минуты (в зависимости от вида краски):

• Фуксин красит интенсивно, причем окрашиваются одинаково хорошо все виды бактерий. Продолжительность окрашивания раствором фуксина вполне достаточна на протяжении 1-2 минут.
• Щелочную метиленовую синь оставляют для окрашивания мазка на 2-3 минуты. Она красит менее сильно, но препарат получается более изящный, к тому же различные бактерии приобретают окраску различной интенсивности. При окраске метиленовой синью у крупных клеток (например, дрожжевых) дифференцируется ядро и цитоплазма.
• Раствор генцианвиолета держат для окраски 3-5 минуты.

Виды красителей для приготовления образцов для микроскопа

Красители в микробиологии являются солями двух типов: 1) кислые красители – у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (пример — эозин); 2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (пример — метиленовый синий).
Окраска клеток дрожжей иодонитротетразолиум хлоридом.

Кислые красители являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).

Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl).

Обычно кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми).

Методы окрашивания основаны либо на микроскопировании в видимом (обычном) свете, либо на флуоресцентной микроскопии. Красителями для светового микроскопа являются метиленовый синий, раствор Люголяи др. Из флуоресцентных красителей применяют магниевую соль 1-анилино-8-нафтален сульфоновой кислоты (Mg-ANS), а также дигидрородамин.

Окраска клеток дигидрородамином в зеленом и красном спектре.

Наиболее простым для проверки жизнеспособ­ности дрожжевых клеток в суспензии является метод с использованием метиленового синего. Этот метод обуслов­лен тем, что метиленовый синий благодаря дыхательной активности клеток быстро редуцируется и теряет окраску. При отмирании клетки становятся более прони­цаемы для метиленового синего, и при отсутствии дыхательной ак­тивности цвет остается синим. Таким образом, метилено­вый синий указывает на отсутствие у клеток дыхательно­го метаболизма, а не на их гибель как таковую, причем существует возмож­ность, что некоторые метаболически активные клетки оказываются не способными к размно­жению, в связи с чем они будут отнесены к мертвым.

Если число жизнеспособных клеток превышает 90%, этим можно пренебречь, но при снижении числа таких клеток менее чем до 90% эта погрешность становится все более значимой. Общее количество клеток в 1 см³ и коли­чество «синих» клеток измеряется в камере для подсчета. Для измерения процента жизнеспособных клеток с точ­ностью 0,5% необходимо насчитать не менее 200 клеток. Для получения большей точности необходимо наличие не менее 600 клеток, причем не менее чем в двух отдельных пробах. Исполь­зовать два раздельных анализа следует потому, что среднее из двух результатов обеспечит боль­шую точность результатов.

Другие красители дают лучшие результаты, например метиленовый фиолетовый.

Как бы то ни было, в настоящее время общепризнано, что информация о проценте жизнеспособных клеток не позволяет гарантировать приемлемое состояние засевных дрожжей. Термин «жизнеспособность» отражает способ­ность дрожжей к быстрому и эффективному сбраживанию, а не состояние «быть живым».

10.1. ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ ПО СТЕПЕНИ ОКИСЛЕНИЯ

В качестве индикаторов жизнеспособности пред­ложены самые разные методы, вклю­чая содержание гли­когена, АТФ или стерола, образование СО₂ или потребле­ние О₂ из раствора глюкозы, а также скорость выделения определенных ионов.

Наиболее удобным методом для определений, которые должны быть выполнены в кратчайшее время, является выделение ионов Н⁺, т. е. снижение значения величины рН, при введении дрожжей в сбраживаемый субстрат.

Для определения жизнеспособности дрожжей по сте­пени окисления дрожжи промывают центрифугировани­ем и затем тщательно перемешивают в 100 см³ дистилли­рованной воды. Через 10 мин добавляют 5 см³ 20%-ного (масс/об) раствора глюкозы и перемешивают еще 10 мин. В ходе инкубации в течение 20 мин каждую минуту изме­ряют рН суспензии. Резкое снижение значения рН сразу же и после добавления раствора глюкозы до < 4 свидетель­ствует об активности дрожжей, а степень окисления кор­рели­рует с изменением величины рН.

Как и метод с использованием метиленового синего, данный метод достаточно быстр и позволяет получить ре­зультаты до внесения дрожжей.

10.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МЕРТВЫХ КЛЕТОК

10.2.1. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ОКРАШИВАНИЕ МЕТИЛЕНОВЫМ СИНИМ

Около 1 г сушеных дрожжей вносят в пробир­ку со стерильным солодовым суслом плот­ностью 8% ви­димых СВ.

Пробирку ставят в термостат при температуре 30°С на 4 ч. За это время все живые клетки, содержащиеся в пробе, выходят из состояния анабиоза и начинают почковаться. Из подмоложенных таким способом дрожжей готовят пре­парат, который окрашивают метиленовый синим, приго­товленным на буферной смеси.

Для прессованных дрожжей и живой культуры нет необходимости в такой процедуре.

Каплю взвеси дрожжей смешивают с каплей синьки на предметном стекле и накрывают покровным стеклом. Мертвые клетки окрашиваются, а живые остаются неок­рашенными. В пяти полях зрения отдельно подсчитыва­ют количество мертвых и живых клеток, процент мерт­вых клеток вычисляют по отношению ко всему количест­ву клеток. Материнскую клетку с неотделившейся почкой принимают за одну клетку.

10.2.2. ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД

Используют люминесцентный микроскоп или люми­несцентный осветитель и флуоро­хром примулин.

Краситель готовят в виде двух растворов: водный рас­твор (1:20 000) и раствор (1:20 000) в фосфатном буфере рН 8–9. Оба раствора хранят в темноте.

Предметные и покровные стекла тщательно обезжи­рены.

При микроскопировании белых вин бактериологиче­ской петлей помещают на предмет­ное стекло каплю осадка и рядом каплю водного раствора примулина, смешивают их и накрывают покровным стеклом, на которое затем на­носят каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла.

При микроскопировании красных вин (в связи с га­шением люминесценции) красный цвет необходимо уст­ранить, что достигается созданием в препарате щелоч­ной среды. Красный цвет вина при этом превращается в синий.

Бактериологической петлей помещают на предметное стекло каплю осадка вина и две капли раствора примули­на в фосфатном буферном растворе рН 8–9. Капли тща­тельно смешивают петлей в течение 1–2 мин, затем накры­вают покровным стеклом, на которое помещают каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла.

Приготовленные препараты рассматривают в люми­несцентном микроскопе в фиоле­товой и синей видимой частях спектра. Для этого пользуются светофильтрами: синим, сине-зеленым, белым и запирающим желтым.

Сначала препарат рассматривают в проходящем свете и подсчитывают общее коли­чество микроорганизмов, а затем – в свете люминесценции, подсчитывая только ко­личество мертвых клеток.

В свете люминесценции живые микроорганизмы не видны, иногда у дрожжевых клеток светится только обо­лочка в виде тонкого зеленого кольца. Мертвые дрожжи и бактерии в свете люминесценции светятся зеленым и жел­тым светом разной интен­сивности.

При подсчете микроорганизмов необходимо учитывать разведение исследуемого материала в 2 раза для белых вин и в 3 раза – для красных.

10.2.3. МЕТОД ЭПИФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Методика позволяет определять количество жизнеспо­собных клеток дрожжей в винах и других сброженных материалах, содержащих их небольшое количество (в мо­мент розлива в бутылки), с использованием эпифлуоресценции, и сравнивается с контрольным методом (подсчет колоний на питательной среде).

Применяют также красители-флуорохромы и люми­несцентный микроскоп.

Препарат готовят на мембранах Миллипор из поликар­боната диаметром 13–25 мм или из ацетилцеллюлозы диа­метром 45 мм.

Испытуемое вино фильтруют под вакуумом через мем­браны, окрашивают и подсчитывают под микроскопом число клеток в см³ с учетом числа клеток и подсчитанных полей, площади фильтрующей мембраны, площади полей микроскопа, объема отфильтрованного образца, числа наблюдаемых полей.

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ»^^^^^^^

УДК 66.663.45

Применение методов окраски дрожжей для оценки их физиологического состояния

С. Г. Давыденко, канд. биол. наук; Л. М. Васильева; Б. Э. Баташов; А. Т. Дедегкаев, канд. техн. наук ОАО «Пивоваренная компания «Балтика»

Ключевые слова: витальные красители; дрожжи; микроскопия;

физиологическая активность; флуоресцентные красители.

Keywords: vital dyes; yeast; microscopy; physiological activity; fluorescent dyes.

Физиологическое состояние засеваемых дрожжей — очень важный фактор для правильного хода брожения, который обеспечивает получение пива требуемого качества.

Состояние дрожжей определяется терминами «жизнеспособность» и «жизненность». Жизнеспособность — соотношение мертвых и живых клеток, жизненность — мера активности метаболизма или физиологического состояния живых клеток. Физиологическое состояние имеет большое значение для ведения технологического процесса пивоварения, поскольку его главный участник — дрожжи. В связи с этим было проведено много исследований, направленных на разработку точного метода измерения состояния дрожжей с использованием современных технологий.

Изучение микроорганизмов объективно осложнено в связи с их размерами, недоступными для восприятия человеческому глазу, который способен различать детали объекта, отстоящие друг от друга не менее чем на 0,08 мм. С помощью светового и электронного микроскопа можно получить большее разрешение — 0,2 мкм и 0,1-0,01 нм соответственно. Увидеть детали строения микроорганизмов сложно, для

этого нужна специальная дорогостоящая техника, основанная на разработке особых способов освещения (косое освещение, люминесценция, микроскопия в темном поле, метод фазового контраста и т. д.). Однако наиболее эффективно применение красителей, позволяющих не только преодолевать проблему практически неокрашеных живых микроорганизмов, попадающих в поле зрения микроскопа, но и выявлять их органел-лы (ядро, цитоплазму, митохондрии) или специфически окрашивать белки, жиры, полисахариды и нуклеиновые кислоты.

Красители широко применяют в современной гистологии и цитологии, для решения задач в прикладной науке и производстве. В пивоварении дрожжи являются основным активным объектом, осуществляющим процесс брожения пивного сусла, поэтому оценка их физиологического состояния необходима для ведения технологического процесса.

Физиологическую активность микроорганизмов можно определить методами окрашивания различными красителями. Окраска проводится для выяснения их морфологии, физиологии, наличия определенных веществ (белков, жиров, полисахаридов, ионов

Окрашивание в видимом свете Флуоресцентные красители

Метиленовый синий Магниевая соль 1-анилин-8-нафтален-

Метиленовый синий + сафранин О сульфоновой кислоты

Раствор Люголя Родамин В

Иодонитротетразолиум хлорид Акридиновый оранжевый

Красный Понсо Бромкрезоловый зеленый

Метиленовый фиолетовый Диацетат флуоресцеина

Дигидрородамин 123

Эозин

Примулин

Эритрозин В

металлов). Физиологическая активность определяет и технологическую эффективность дрожжей, применяемых в производстве.

Методы окрашивания основаны либо на микроскопировании в видимом свете, либо на флуоресцентной микроскопии. Наиболее широко распространенные красители при микро-скопировании в видимом свете — ме-тиленовый синий, сафранин, раствор Люголя, иодонитротетразолиум хлорид (INT) и т. д. К флуоресцентным относят такие красители как магниевая соль 1-анилин-8-нафталенсульфоновой кислоты (Mg-ANS), родамин и т. д. (см. таблицу) [1, 2].

Окрашивание метиленовым синим: 0,01 г метиленового синего и 2,0 г двуводного цитрата натрия растворяют в 10 мл дистиллированной воды, фильтруют и доводят объем до 100 мл. Для окраски используют суспензию дрожжей концентрацией 107 клеток/мл. Тщательно перемешивают образец дрожжей. Делают ряд разведений в физиологическом растворе, чтобы получить удобную для подсчета концентрацию 107 клеток/ мл. Смешивают суспензию клеток и краситель в соотношении 1:1. Закрывают препарат покровным стеклом и производят подсчет не менее 500 клеток. Окрашенные синие клетки считаются мертвыми [3].

Окрашивание сафранином и метиленовым синим: готовят 5%-ный раствор танина и 1%-ный раствор сафранина на дистиллированной воде. Раствор метиленового синего готовят, как описано выше. Суспензию клеток центрифугируют при 4000 мин-1 в течение 5 мин. Сливают надосадочную жидкость, промывают физиологическим раствором и снова центрифугируют при тех же условиях. На обезжиренное стекло наносят каплю суспензии 107 клеток/ мл. После высыхания капли при комнатной температуре препарат фиксируют в пламени. Далее заливают стекло раствором метиленового синего на 4 мин при комнатной температуре. Смывают струей теплой воды. Заливают стекло свежеприготовленным 5%-ным раствором таннина на 2 мин. Таннин играет роль бесцветного протравного красителя. Смывают краситель под струей воды. Заливают стекло раствором сафранина на 16 мин, затем смывают краситель [1].

Сафранин (арабск. zafaran — шафран) — анилиновый краситель,

с;

ПИВО и НАПИТКИ

б • 2011

‘ГЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ |

применяемым в гистологическом технике для выявления клеточных ядер, которые окрашиваются в красный цвет. Сафранин (иногда Шафраник) — красящее вещество, принадлежащее к группе азокрасок, основного характера, обыкновенно в виде солянокислых солей. Самую простую формулу имеет фено-С, сложнее состав толу-С, содержащего метиловые группы. В технику микроскопи-рования сафранин введен в 1881 г. (Hermann, Flemming, Pfitzner) для окраски ядер и главным образом кариокинеза и с тех пор получил широкое применение [4].

Окрашивание раствором Люголя: 2 г иодистого калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды, к раствору добавляют 1 г кристаллического иода. После растворения иода полученный раствор в колбе доводят дистиллированной водой до объема 300 мл. Смешивают суспензию и краситель в соотношении 1:1. Закрывают препарат покровным стеклом и производят подсчет не менее 500 клеток. Оценивают интенсивность коричневого окрашивания. Более окрашенные клетки содержат больше гликогена [5].

Окрашивание иодонитроте-тразолиум хлоридом (INT): 40 мг INT (Sigma) растворяют в 10 мл стерильной воды до конечной концентрации 0,4%. Дрожжи центрифугируют 5 мин при 4000 мин-1, сливают надосадочную жидкость и снова ресуспензируют в физиологическом растворе до конечной концентрации 107 клеток/мл. К 1 мл дрожжевой суспензии добавляют 0,4 мл 0,4%-ного раствора INT и инкубируют 30 мин при 30 °С. Водный раствор красителя свободно проникает в клетки. В результате окислительно-восстановительной реакции в живых клетках образуется нерастворимое вещество — фармазан (красного или малинового цвета). Мертвые же клетки остаются неокрашенными [6, 7].

Окрашивание флуоресцентной магниевой солью 1-анилин-8-нафталенсульфоновой кислоты (Mg-ANS): 300 мг Mg-ANS (Sigma) растворяют в 2 мл спирта и добавляют 98 мл стерильной воды до конечной концентрации 0,3%. Этот раствор можно хранить при 4 °С в стеклянных бутылках из темного стекла в течение 6 мес. Для выполнения процедуры окрашивания дрожжи центрифугируют 5 мин при 4000 мин-1, сливают надосадочную жидкость и снова ресу-

Рис. 1. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, окрашенные метиленовым синим (увеличение хб30)

спензируют в физиологическом растворе до конечной концентрации 10 млн клеток в 1 мл. К 0,5 мл этой суспензии добавляют 0,5 мл 0,3%-ного раствора Mg-ANS и инкубируют 5 мин при 25 °С. Живые клетки не окрашиваются красителем, а мертвые имеют желто-зеленое флуоресцентное свечение при микроскопировании [8, 9].

Окрашивание дигидрородамином 123: в 1 мл 0,1 M буфер Tris (2-Amino-2-hydroxy-methyl-1,3-propanediol) HCl pH 8,0 растворяют 2 мг дигирородами-на 123 (Fluka). К 100 мкл суспензии дрожжей с концентрацией 107 клеток/ мл добавляют 1 мл 0,2%-ного раствора дигидрородамина 123, который окисляется до флуоресцирующего родамина в присутствии активных радикалов кислорода [10].

Различные методы окрашивания могут дать дополнительную информацию о том, что происходит или уже произошло с клеткой. Производят окрашивание как прижизненных, так и фиксированных препаратов.

Наибольшее распространение получил метод выявления мертвых клеток на прижизненных препаратах микроорганизмов с помощью мети-ленового синего (рис. 1). После по-

Рис. 2. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, окрашенные раствором Люголя (увеличение х1000)

падания в клеточную цитоплазму под действием ферментов редуктаз этот краситель восстанавливается живыми дрожжевыми клетками до бесцветных соединений. Эффективность данного метода зависит не только от состояния клеточной мембраны, но и от активности определенных оксидоредуктаз в клетке, и таким образом он отражает и жизнестойкость, и жизнеспособность дрожжей (мертвые клетки окрашиваются в синий цвет) [3].

Для выявления запасного полисахарида дрожжей — гликогена — дрожжи окрашивают раствором Люголя. В результате клетки дрожжей становятся желтыми, а гликоген — коричневым (рис. 2). Количество гликогена в клетках дрожжей меняется в зависимости от их возраста и условий культивирования. У очень молодых клеток гликоген отсутствует, а клетки при окрашивании раствором иода приобретают бледно-желтый цвет [5]. Постепенно дрожжи накапливают гликоген, и при обработке раствором Люголя выявляются темно-коричневые гранулы гликогена, свидетельствующие о накоплении питательных веществ клеткой.

Метод, основанный на редукции трифенилтеразолиновых солей

ФШЦЛТЛ

ООО «ФЕАИЦАТА ХОЛДИНГ»

Производитель пребиотиков и витаминных премиксов на основе лактулозы

Телефон/факс: (495) 648-69-03, (495) 911-70-54 E-mail: i.vasileva@felizata.ru www.felizata.ru

5 • 2011

ПИВО и НАПИТКИ 9

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

на основе изменения активности Д-глицеральдегид-3-фосфат NAD ок-сидоредуктазы, характеризует активность клеток при брожении. Проникая в дрожжевую клетку, иодонитротетра-золиум хлорид (iodonitrotetrazolium chloride, INT) образует за счет клеточных ферментов нерастворимые гранулы иодонитротетразолиум-формазана, которые имеют интенсивную красную окраску, наблюдаемую при микроско-пировании в светлом поле (рис. 3). Количество и размер гранул свидетельствует об активности окислительно-восстановительных процессов в клетке [6, 7].

Более полную информацию о физиологическом состоянии клеток дает

Рис. 3. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, окрашенные раствором иодонитротетразолиум хлорида (INT) (увеличение х1000)

окраска фиксированных препаратов метиленовым синим, таннином и сафранином (рис. 4).

а 6

Рис. 5. Клетки дрожжей в видимом свете и окрашенные Mg-ANS (увеличение х1000): а — микроскопирование в видимом свете; б — флуоресцентное микроскопирование с Mg-ANS

а

Рис. б. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, окрашенные дигидрородамином 123 (увеличение х1000): а — красный; б — зеленый светофильтр

а 6

Рис. 7. Окрашенные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae: а — дигидрородамином 123; б — метиленовым синим (увеличение х1000)

Рис. 4. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, окрашенные метиленовым синим, таннином и сафранином (увеличение хб30)

Суть процессов окраски заключается в том, что остатки фосфорной кислоты, которые обычно связаны с ядерными белками (чаще всего ги-стонами), при вытеснении последних легко вступают в химические реакции с основными красителями. Для этого могут быть использованы сафранин О, янус зеленый В, толуидиновый синий, тионин, азур А и некоторые другие красители, разведенные растворы которых в уксусной кислоте избирательно окрашивают хроматин. Во время активной транскрипции определенного участка ДНК формирующие хроматин гистоны покидают поверхность ДНК и освобождаются фосфорные группы молекулы ДНК, которые вступают в реакцию с сафранином и другими основными красителями. Таким образом, «покраснение» клеток может свидетельствовать об активном процессе транскрипции, а следовательно, и об активном метаболизме. Метиленовый синий окрашивает белки цитоплазмы [1].

Для определения жизнеспособности дрожжевых клеток используют Mg-ANS. Проникая в клетку, Mg-ANS образует флуоресцирующие желто-зеленые комплексы с белками цитоплазмы (рис. 5). По сравнению с окраской метиленовым синим для детекции используется в 1000 раз меньше красителя, что снижает вероятность ингибирования им клеток. Результаты, полученные этим методом, считаются более точными, но требуют наличия хорошей техники для микроскопиро-вания. Живые клетки не окрашиваются красителем, а мертвые имеют желто-зеленое флуоресцентное свечение при микроскопировании [8, 9].

Выявление активных форм кислорода (АФК) в клетке свидетельствует либо о ее старении, либо о том, что она находится в состоянии стресса. Метод дигидрородаминового окрашивания

10 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2011

ТТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

позволяет оценивать количество АФК по количеству флуоресцирующих (красных или зеленых в зависимости от использования соответствующего фильтра) клеток (рис. 6). Дигидроро-дамин 123 (Fluka) окисляется до флуоресцирующего родамина [10].

Окрашивание дигидрородами-ном 123 — чувствительный метод, позволяющий производить оценку физиологического состояния живых, но уже ослабленных клеток, что дает важную информацию о ходе процесса брожения и позволяет диагностировать проблемы, влияющие на жизнеспособность. Для сравнения на рис. 7 представлены препараты одной и той же суспензии дрожжей, окрашенные дигидрородамином 123 (рис. 7, а) и метиленовым синим (рис. 7, б) при использовании зеленого светофильтра.

Дигидрородамин 123 выявляет ослабленные клетки, неспособные эффективно бороться с АФК (см. рис. 7, а), в то время как метиленовый синий окрашивает уже мертвые клетки (см. рис. 7, б). Такое окрашивание дает информацию о том, как будут вести себя дрожжи во время брожения.

Применение красителей для оценки физиологического состояния дрожжей в пивоварении достаточно велико, однако многие флуоресцентные красители широко не используются, так как для них необходимы дорогостоящие микроскопы. Наиболее применяемый — классический метод окрашивания метиленовым синим, дающий стабильные, но иногда завышенные результаты из-за незначительной токсичности самого красителя. Именно этот краситель широко используется в пивоварении для оценки технологической эффективности дрожжей. Остальные красители применяют для уточнения результатов, полученных с помощью метиленового синего, например Mg-ANS, или для характеристики определенных процессов в клетке (INT, дигидрородамин 123).

ЛИТЕРАТУРА

1. Селиванов, Е. В. Красители в биологии и медицине: справочник/Е. В. Селиванов. — Барнаул: Азбука, 2003. — 44 с.

2. http ://www.propivo .ru / prof/ technology / 22 / izmerenie.htm.

3. Smart, K.A. Use of Methylene Violet Staining Procedures to Determine Yeast Viability and Vitality/K. A. Smart, K. M. Chambers, I. Lambert, C. J. Jenkins // Journal-American society of brewing chemists. — 1999. — Vol. 57. — № 1. — P. 18-23.

4. top//bigmeden.ru/article.

5. Теппер, Е. З. Практикум по микробиологии: изд. 2-е, перераб. и доп./Е. З. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева. — М.: Колос, 1979. — 216 с.

6. Munujos, P. Assay of succinate dehydrogenase activity by a colorimetric-continuous method using iodonitrotetrazolium chloride as electron acceptor/P. Munujos, J. Coll-Cantí, F. González-Sastre, F. Gella // J. Anal Biochem. — 1993. — Vol. 212. — № 2. — P. 506-509.

7. Mailloux, R. J. The monitoring of nucleotide diphosphate kinase activity by blue native polyacry lamide gel electrophoresis/ R. J. Mailloux, R. Darwich, J. Lemire, V. Appanna // Electrophoresis. — 2008. — Vol. 29. — № 7. — P. 1484-1489.

8. Jenkins, C.L. Impact of Serial Repitching on Lager Brewing Yeast Quality/C. L. Jenkins [et al.] // Journal-American society of brewing chemists. — 2003. — Vol. 61. — № 1. — P. 1-9.

9. Van Zandycke, S. M. Determination of Yeast Viability Using Fluorophores/S. M. Van Zandycke, O. Sima, S. Gualdoni, A. Smart // Journal-American society of brewing chemists. — 2003. — Vol. 61. — № 1. — P. 15-22.

10. Nevzglyadova, O. V. Bud selection and apoptosis-like degradation of nuclei in yeast heterokaryons: a KAR1 effect/O. V. Nevzglyadova, A. V. Ar-tyomov, E. V. Mikhailova, T. R. Soidla // Molecular Genetics and Genomics. — Vol. 274. — № 4. — P. 419-427. ®

ДРОЖЖЕЙ

Для
микроскопирования дрожжей следует
приготовить препарат «раздавленная
капля» из чистых культур дрожжей ‑
винных, пекарских и диких. Приготовленные
препараты изучить под микроскопом со
средним увеличением (с объективом х40).
При этом необходимо рассмотреть, прежде
всего, форму клетки и ее строение,
обратить внимание на клеточную оболочку,
цитоплазму, вакуоли и включения запасных
питательных веществ. Цитоплазма при
микроскопировании представляет собой
темную зернистую массу, вакуоли и капли
жира в виде светлых (блестящих) пятнышек,
гликоген ‑ в виде уплотненных зерен.
Необходимо убедиться в неподвижности
дрожжевых клеток.

Затем
изучают способы бесполого размножения
дрожжей. Для этого нужно отыскать в поле
зрения микроскопа почкующиеся клетки.
Все препараты зарисовать при работе с
объективом х40. На рисунках обозначить
анатомическое строение дрожжевых
клеток, почкующиеся клетки. В выводе
указать отличие изученных препаратов
дрожжей по форме.

Определить
относительное количество живых и мертвых
клеток в пекарских дрожжах ‑ старых
и подмоложенных. К капле суспензии
дрожжей на предметном стекле добавить
каплю слабого раствора (1:1000) метиленового
синего, размешать, накрыть покровным
стеклом. Мертвые клетки прокрашиваются
быстрее и ярче вследствие посмертного
повышения проницаемости клеточной
оболочки. Препарат зарисовать в цвете.

Раздел 2.Определение включений в клетках дрожжей

В
процессе
жизнедеятельности микроорганизмов в
цитоплазме клеток могут формироваться
морфологические образования, представляющие
собой либо продукты обмена клетки, либо
запасные питательные вещества. Включения
различны по своей химической природе.
Это могут быть жироподобные вещества,
полисахариды (гликоген, крахмал,
гранулеза), серополифосфаты (волютин),
кристаллы щавелевой кислоты и др. Они
не являются постоянными компонентами
клетки, они образуются в зависимости
от условий культивирования, возраста
культуры и могут использоваться в
метаболизме клетки.

Клеточные
включения могут выявляться цитохимическими
методами.

а).
Определение полисахаридов (гликогена
и гранулезы)

1. На
   предметное стекло наносят небольшую
   каплю микробной суспензии, добавляют
   каплю концентрированного раствора
   Люголя и выдерживают 10-15 минут при
   комнатной температуре.

2. Накрывают
   покровным стеклом, удаляют избыток
   жидкости и микроскопируют с сухой
   системой либо с иммерсией.

Гранулы
крахмалоподобных веществ (гранулеза)
окрашены в синий, а гранулы гликогеноподобных
веществ (крахмал) ‑в красновато-коричневый
цвет.

Окрашивание
гликогена происходит в кислой среде,
поэтому перед выявлением в клетках
гликогена среду, в которой выращивали
микроорганизмы, подкисляют либо на
предметное стекло вместо воды наносят
каплю 0,5%-го раствора HCl
и в ней эмульгируют исследуемую культуру.

б).
Обнаружение жироподобных веществ

Жировые
включения или липидные гранулы в клетках
микроорганизмов могут быть представлены
нейтральными жирами и поли-β-оксимасляной
кислотой. Коэффициент преломления жиров
и гранул, состоящих из нейтральных
жиров, отличается от коэффициента
преломления протоплазмы, поэтому в
препарате «раздавленная капля»
жир виден в клетках в виде блестящих
ярких капелек. Препарат необходимо
рассматривать в затемненном поле зрения,
опустив конденсор и закрыв диафрагму
(объектив х40). Гранулы поли-β-оксимасляной
кислоты выявляют с помощью жирорастворимого
красителя судана III.

1. Наносят
   каплю густой микробной взвеси на
   предметное стекло. Добавляют каплю
   формалина (40%-го), либо 5%-го раствора HCl
   и выдерживают 5 минут (формалин убивает
   клетку и разрыхляет ее оболочку).

2. Добавляют
   каплю метиленового синего (1:10 либо
   1:40) и выдерживают 10 минут.

3. Добавляют
   каплю концентрированного раствора
   судана (III)
   в 90% этаноле и выдерживают 5 минут.
   Накрывают покровным стеклом. Микроскопируют
   с сухой или иммерсионной системой.

Клетки
окрашены в синий, включения жира — в
розово-оранжевый цвет.

в).
Выявление волютина

Волютин-полиметафосфат,
в клетках чаще содержится в виде зерен
диаметром 0,3 мкм, иногда в дисперсном
состоянии. Волютин встречается в клетках
многих бактерий и большинства дрожжей.
Волютин дает явление метахромазии; на
этом основана его окраска метиленовым
синим. Волютин растворяется в слабых
кислотах и щелочах, но после окраски
становится кислотоустойчивым, на этом
основан метод Омелянского.

Окраска
метиленовым синим:
фиксированный мазок дрожжей окрашивают
метиленовым синим 3-5 мин, промывают,
сушат и микроскопируют в иммерсионной
системе. Зерна волютина выглядят
красно-фиолетовыми на фоне голубой
протоплазмы.

Метод
Омелянского:
фиксированный мазок окрашивают в течение
30 с фуксином Циля, затем обесцвечивают
1% раствором серной кислоты 30 мин. и после
промывания водой докрашивают метиленовым
синим 1 мин.; промывают водой, высушивают
и микроскопируют в иммерсионной системе.
Зерна волютина ‑ ярко-красные,
протоплазма ‑ голубая. Препараты
зарисовать в цвете.

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #