Тимидин таблетки инструкция по применению взрослым

Тизанидин-СЗ — инструкция по применению

Синонимы, аналоги

Статьи

Регистрационный номер

ЛП-005748

Торговое наименование препарата

Тизанидин-СЗ

Международное непатентованное наименование

Тизанидин

Лекарственная форма

таблетки

Состав

1 таблетка содержит:

действующее вещество: тизанидина гидрохлорид — 2,288 мг/ 4,576 мг в пересчете на тизанидин — 2 мг/ 4 мг;

вспомогательные вещества: лактозы моногидрат — 70,0 мг/140,0 мг; целлюлоза микрокристаллическая 102 — 64,912 мг/129,824 мг; кремния диоксид коллоидный (аэросил) — 1,4 мг/ 2,8 мг; магния стеарат — 1,4 мг/ 2,8 мг.

Описание

Таблетки белого или почти белого цвета, круглые, плоскоцилиндрические с фаской и риской с одной стороны.

Фармакотерапевтическая группа

Миорелаксант центрального действия

Код АТХ

M03BX

Фармакодинамика:

Тизанидин — миорелаксант центрального действия, Основная точка приложения его действия находится в спинном мозге. Стимулируя пресинаптические альфа₂-рецепторы, он подавляет высвобождение возбуждающих аминокислот, которые стимулируют рецепторы к N-метил-В- аспартату (NMDA-рецепторы). Вследствие этого на уровне промежуточных нейронов спинного мозга происходит подавление полисинаптической передачи возбуждения. Поскольку именно этот механизм отвечает за избыточный мышечный тонус, то при его подавлении мышечный тонус снижается. В дополнение к миорелаксирующим свойствам, тизанидин оказывает также центральный умеренно выраженный анальгезирующий эффект.

Препарат Тизанидин-СЗ эффективен как при остром болезненном мышечном спазме, так и при хронической спастичности спинального и церебрального генеза. Уменьшает спастичность и клонические судороги, вследствие чего снижается сопротивление пассивным движениям и увеличивается объем активных движений.

Миорелаксирующий аффект (измерение по шкале Ашворта и с помощью «маятникового» теста) и побочные действия (снижение частоты сердечных сокращений (ЧСС) и снижение артериального давления (АД)) препарата зависят от концентрации тизанидина в плазме крови.

Фармакокинетика:

Всасывание

Тизанидин всасывается быстро и почти полностью. Максимальная концентрация в плазме крови (С_mах) достигается примерно через 1 час после приема препарата. По причине выраженного метаболизма при «первом прохождении» через печень среднее значение биодоступности составляет около 34 %. Сmах тизанидина равно 12,3 нг/мл и 15,6 нг/мл после однократного и многократного приема тизанидина в дозе 4 мг соответственно.

Распределение

Средний объем распределения в равновесном состоянии при внутривенном введении составляет 2,6 л/кг. Связывание с белками плазмы крови составляет 30 %.

Метаболизм

Тизанидин быстро и в значительной степени (около 95 %) метаболизируется в печени. Invitro тизанидин метаболизируется в основном изоферментом CYP1A2 системы цитохрома Р450. Метаболиты неактивны.

Выведение

Средний период полувыведения тизанидина из системного кровотока составляет 2-4 ч, выведение осуществляется преимущественно почками (приблизительно 70 % дозы) в виде метаболитов; на долю неизмененного вещества приходится около 4,5 %.

Влияние пищи

Одновременный прием пищи не влияет на фармакокинетику тизанидина (при применении 4 мг в виде таблеток или 12 мг в виде капсул с модифицированным высвобождением). Несмотря на то, что значение С_mах возрастает на 1/3 при приеме после еды, это не является клинически значимым. Существенного влияния на всасывание (AUC, площадь под фармакокинетической кривой «концентрация-время») не отмечается. Тизанидин в диапазоне доз от 1 мг до 20 мг обладает линейной фармакокинетикой.

Особенности фармакокинетики у отдельных групп пациентов

Пациенты с нарушением функции почек

У пациентов с нарушением функции почек (клиренс креатинина (КК) ≤ 25 мл/мин) С_mах тизанидина в плазме крови в 2 раза выше, чем у здоровых добровольцев, конечный период полувыведения достигает 14 часов, что приводит к увеличенной (примерно в 6 раз) системной биодоступности тизанидина (измеренной по AUC).

Пациенты с нарушением функции печени

Специальных исследований у пациентов данной категории не проводилось. Поскольку тизанидин преимущественно метаболизируется в печени изоферментом CYP1A2 системы цитохрома, нарушение функции печени может приводить к увеличению системного воздействия препарата.

Пациенты старше 65 лет

Данные по фармакокинетике у пациентов данной группы ограничены.

Зависимость от пола и расовой принадлежности

Пол не оказывает влияния на фармакокинетические свойства тизанидина. Влияние этнической и расовой принадлежности на фармакокинетику тизанидина не изучалось.

Показания:

Болезненный мышечный спазм:

связанный со статическими и функциональными заболеваниями позвоночника (шейный и поясничный синдромы);

после хирургических вмешательств, например, по поводу грыжи межпозвонкового диска или остеоартроза тазобедренного сустава.

Спастичность скелетных мышц при неврологических заболеваниях, например, при рассеянном склерозе, хронической миелопатии, дегенеративных заболеваниях спинного мозга, последствиях нарушений мозгового кровообращения и детском церебральном параличе (пациенты старше 18 лет).

Противопоказания:

— Повышенная чувствительность к тизанидину или к любому другому компоненту препарата.

— Нарушение функции печени тяжелой степени.

— Одновременное применение с мощными ингибиторами изофермента CYP1А2, такими как флувоксамин или ципрофлоксацин.

— Не рекомендовано пациентам с редкими наследственными заболеваниями, такими как дефицит лактазы, непереносимость лактозы, глюкозо-галактозная мальабсорбция, так как лекарственная форма содержит лактозу.

— Опыт применения препарата у пациентов младше 18 лет ограничен. Применение препарата Тизанидин-СЗ у пациентов данной популяции не рекомендовано.

С осторожностью:

Рекомендуется соблюдать осторожность при применении препарата у пациентов старше 65 лет, пациентов с нарушением функции почек, пациентов с нарушениями функции печени средней степени тяжести. Необходимо соблюдать осторожность при одновременном применении препарата Тизанидин-СЗ с препаратами, удлиняющими интервал QT (например, цисаприд, амитриптилин, азитромицин).

Беременность и лактация:

Беременность

Поскольку контролируемые исследования применения тизанидина у беременных женщин не проводились, его не следует применять в период беременности, за исключением тех случаев, когда потенциальная польза превышает возможный риск.

В исследованиях у животных не выявлено явлений тератогенности. При применении в дозах 10 и 30 мг/кг в сутки у животных отмечено увеличение срока гестации, зарегистрированы случаи пренатальной и постнатальной потери плода, а также задержка развития плода. При применении вышеуказанных доз у самок отмечались выраженные признаки миорелаксации и седации. Исходя из площади поверхности тела, указанные дозы превышали максимальную рекомендуемую дозу для человека (0,72 мг/кг в сутки) в 2,2 и 6,7 раз.

Грудное вскармливание

В исследованиях у животных тизанидин выделялся в небольших количествах с молоком лактирующих самок. Не следует применять препарат в период грудного вскармливания, так как нет данных о проникновении тизанидина в грудное молоко у человека.

Тест на беременность

Перед началом применения препарата Тизанидин-СЗ у пациенток с сохраненным репродуктивным потенциалом рекомендовано получить результат теста на беременность.

Влияние на фертильность

В исследованиях у животных не отмечалось неблагоприятного влияния на фертильность особей мужского и женского пола при применении тизанидина в дозе 10 мг/кг в сутки и 3 мг/кг/ сутки соответственно. Отмечалось уменьшение фертильности у особей мужского пола, получавших тизанидин в дозе, превышающей 30 мг/кг в сутки, и у особей женского пола — в дозе, превышающей 10 мг/кг сутки. Исходя из площади поверхности тела, указанные дозы превышали максимальную рекомендуемую дозу для человека (0,72 мг/кг в сутки) в 2,2 и 6,7 раз. При применении указанных доз со стороны матери отмечались поведенческие эффекты и клинические признаки, включающие выраженную седацию, уменьшение массы тела и атаксию.

Способ применения и дозы:

Препарат Тизанидин-СЗ обладает узким терапевтическим индексом и высокой вариабельностью концентрации тизанидина в плазме крови, поэтому необходим тщательный подбор дозы.

Дозу и режим дозирования следует подбирать индивидуально в зависимости от потребностей пациента. Применение препарата в начальной дозе 2 мг 3 раза в день снижает риск развития побочных эффектов.

Препарат принимают внутрь. Таблетки 2 мг и 4 мг могут быть разделены на две равные части.

При болезненном мышечном спазме препарат Тизанидин-СЗ применяют, как правило, в дозе 2 мг или 4 мг 3 раза в сутки.

В тяжелых случаях возможно дополнительное применение 2 мг или 4 мг (предпочтительно перед сном из-за возможного усиления сонливости).

При спастичности скелетных мышц, обусловленной неврологическими заболеваниями, начальная суточная доза не должна превышать 6 мг, разделенных на 3 приема. Дозу можно повышать постепенно, на 2-4 мг, с интервалами от 3-4 до 7 дней. Как правило, оптимальный терапевтический эффект достигается при суточной дозе от 12 до 24 мг, разделенной на 3 или 4 приема через равные промежутки времени. Не следует превышать дозу 36 мг в сутки.

Применение у пациентов старше 65 лет

Опыт применения препарата Тизанидин-СЗ у пациентов в возрасте старше 65 лет и старше ограничен. Рекомендуется начинать терапию с минимальной дозы с постепенным повышением до достижения оптимального соотношения переносимости и эффективности терапии.

Применение у пациентов с нарушениями функции почек Лечение пациентов с почечной недостаточностью (КК менее 25 мл/мин) рекомендуется начинать с дозы 2 мг 1 раз в день. Повышение дозы проводят малыми «шагами» с учетом переносимости и эффективности. При необходимости достижения более выраженного эффекта, рекомендуется сначала увеличить дозу, применяемую 1 раз в сутки, после чего увеличивают кратность применения.

Применение у пациентов с нарушениями функции печени

Применение препарата Тизанидин-СЗ у пациентов с нарушением функции печени тяжелой степени противопоказано.

У пациентов с нарушением функции печени средней степени тяжести препарат следует применять с осторожностью; рекомендовано начинать терапию с минимальной дозы, с постепенным повышением до достижения оптимального соотношения переносимости и эффективности терапии. Рекомендации по контролю показателей функции печени указаны в разделе «Особые указания».

Прерывание лечения

При прекращении терапии препаратом Тизанидин-СЗ с целью уменьшения риска развития рикошетной гипертензии и тахикардии следует медленно снижать дозу до полной отмены препарата, в особенности у пациентов, получающих высокие дозы препарата в течение длительного времени.

Побочные эффекты:

При приеме малых доз, рекомендуемых для купирования болезненного мышечного спазма, отмечались сонливость, повышенная утомляемость, головокружение, сухость во рту, снижение АД, тошнота, желудочно-кишечные расстройства, повышение активности печеночных трансаминаз. Обычно вышеописанные побочные реакции умеренно выражены и преходящи.

При приеме более высоких доз, рекомендуемых для лечения спастичности, вышеперечисленные HP возникают чаще и более выражены, однако они редко требуют прекращения отмены препарата в связи с тяжестью ПР. Кроме того, могут возникать следующие явления: брадикардия, мышечная слабость, бессонница, нарушения сна, галлюцинации, гепатит.

Нежелательные реакции (HP) сгруппированы в соответствии с классификацией органов и систем органов MedDRA, в пределах каждой группы перечислены в порядке уменьшения частоты встречаемости. Для оценки частоты развития HP использованы следующие критерии: очень часто (≥ 1/10); часто (от ≥ 1/100, < 1/10); нечасто (≥ 1/1000, <1/100); редко (≥ 1/10000, < 1/1000); очень редко (< 1/10000), включая отдельные сообщения.

Нарушения со стороны нервной системы: очень часто — сонливость, головокружение.

Нарушения психики: часто — бессонница, нарушения сна.

Нарушения со стороны сердца: нечасто — брадикардия.

Нарушения со стороны сосудов: часто — снижение АД (в отдельных случаях выраженное, вплоть до циркуляторного коллапса и потери сознания).

Нарушения со стороны пищеварительной системы: очень часто — желудочно-кишечные расстройства, сухость во рту; часто — тошнота.

Нарушения со стороны скелетно-мышечной и соединительной ткани: очень часто — мышечная слабость.

Общие расстройства и нарушения в месте введения: очень часто — повышенная утомляемость.

Лабораторные и инструментальные данные: часто — повышение активности печеночных трансаминаз. При резкой отмене препарата Тизанидин-СЗ после продолжительного лечения и/или приема высоких доз препарата (а также после одновременного применения вместе с гипотензивными препаратами) отмечалось развитие тахикардии и повышения АД, способное в отдельных случаях привести к острому нарушению мозгового кровообращения, в связи с чем дозу препарата Тизанидин-СЗ следует снижать постепенно до полной отмены препарата.

Отдельные сообщения о HPпо данным применения в клинической практике

Поскольку в пострегистрационном периоде сообщения о HP поступают в добровольном порядке из популяции неопределенного размера, достоверно оценить частоту их возникновения не представляется возможным (частота неизвестна).

Нарушения со стороны иммунной системы: реакции гиперчувствительности, включая анафилактические реакции, ангионевротический отек и крапивницу.

Нарушения психики: галлюцинации, спутанность сознания.

Нарушения со стороны нервной системы: головокружение.

Нарушения со стороны органа зрения: затуманивание зрения.

Нарушения со стороны печени и желчевыводящих путей: гепатит, печеночная недостаточность.

Нарушения со стороны кожи и подкожных тканей: кожная сыпь, эритема, кожный зуд, дерматит.

Общие расстройства и нарушения вместе введения: астения, синдром отмены.

Если любые из указанных в инструкции побочных эффектов усугубляются, или Вы заметите любые другие побочные эффекты не указанные в инструкции, сообщите об этом врачу.

Передозировка:

К настоящему времени получено несколько сообщений о передозировке препаратом Тизанидин-СЗ, включая случай, когда принятая доза составила 400 мг. Во всех случаях выздоровление прошло без особенностей.

Симптомы: тошнота, рвота, снижение АД, удлинение интервала QT (с), головокружение, сонливость, миоз, беспокойство, угнетение дыхания, кома.

Лечение. Для выведения препарата из организма рекомендуется многократное применение активированного угля. Форсированный диурез также, возможно, ускорит выведение тизанидина. В дальнейшем проводят симптоматическое лечение.

Взаимодействие:

При применении препарата Тизанидин-СЗ с ингибиторами изофермента CYP1A2 возможно повышение концентрации тизанидина в плазме крови. В свою очередь, повышение концентрации тизанидина в плазме крови может приводить к симптомам передозировки препаратом, в том числе удлинению интервала QT(c).

Одновременное применение препарата Тизанидин-СЗ с индукторами изофермента CYP1A2 может приводить к снижению концентрации тизанидина в плазме крови, что может приводить к уменьшению терапевтического эффекта препарата.

Противопоказанные комбинации с тизанидином

Одновременное применение тизанидина с флувоксамином или ципрофлоксацином, ингибиторами изофермента CYP1А2, противопоказано. При применении тизанидина с флувоксамином или ципрофлоксацином отмечается соответственно 33-кратное и 10-кратное увеличению AUC тизанидина. Результатом одновременного применения может оказаться значимая и длительная гипотензия сопровождающаяся сонливостью, головокружением, снижением скорости психомоторных реакций (в отдельных случаях вплоть до циркуляторного коллапса и потери сознания).

Не рекомендуемые комбинации с тизанидином

Не рекомендуется применять тизанидин одновременно с другими ингибиторами изофермента CYP1A2 — антиаритмическими препаратами (амиодарон, мексилетин, пропафенон), циметидином, некоторыми фторхинолонами (эноксацин, пефлоксацин, норфлоксацин), рофекоксибом, пероральными контрацептивами, тиклопидином.

Комбинации с тизанидином, требующие соблюдения осторожности

Необходимо соблюдать осторожность при одновременном применении препарата Тизанидин-СЗ с препаратами, удлиняющими интервал QT (например, цизаприд, амитриптилин, азитромицин).

Гипотензивные препараты

Одновременное применение препарата Тизанидин-СЗ с гипотензивными препаратами, включая диуретики, иногда может вызывать выраженное снижение АД (в отдельных случаях вплоть до циркуляторного коллапса и потери сознания) и брадикардию.

При резкой отмене препарата Тизанидин-СЗ после одновременного применения с гипотензивными препаратами отмечалось развитие тахикардии и повышение АД, которое в отдельных случаях может привести к острому нарушению мозгового кровообращения.

Рифампицин

Одновременный прием тизанидина и рифампицина приводит к 50 % снижению концентрации тизанидина в плазме крови. Вследствие этого терапевтическое действие препарата может снижаться, что может иметь клиническую значимость для некоторых пациентов. Следует избегать длительного одновременного применения рифампицина и тизанидина при невозможности рекомендуется тщательный подбор дозы тизанидина (увеличение).

Курение табака

Системная биодоступность тизанидина у курящих пациентов (более 10 сигарет в день) снижена примерно на 30 %. Длительная терапия препаратом у пациентов данной категории может потребовать более высоких доз тизанидина, чем средние терапевтические.

Алкоголь

Во время терапии препаратом следует избегать приема алкоголя, так как он может повысить вероятность развития нежелательных явлений (например, снижения АД и заторможенности). Тизанидин может усиливать угнетающее действие алкоголя на центральную нервную систему.

Другие лекарственные средства

Седативные, снотворные препараты (бензодиазепин, баклофен) и другие препараты, такие как антигистаминные препараты, могут также усиливать седативный эффект тизанидина. Следует избегать приема препарата с другими агонистами альфа₂-адренорецепторов (например, клонидином) вследствие потенциального усиления гипотензивного эффекта.

Особые указания:

Гипотензия может возникать на фоне применения препарата Тизанидин-СЗ, а также как результат лекарственного взаимодействия с ингибиторами изофермента CYP1A2 и/или гипотензивными препаратами. Выраженное снижение АД может приводить к потере сознания и циркуляторному коллапсу.

Сообщалось о случаях нарушений функции печени, связанных с тизанидином, однако при применении суточной дозы до 12 мг эти случаи отмечались редко. В связи с этим рекомендуется контролировать функциональные «печеночные пробы» 1 раз в месяц в первые 4 месяца лечения у пациентов, которые получают тизанидин в суточной дозе 12 мг и выше, а также в тех случаях, когда наблюдаются клинические признаки, позволяющие предположить нарушение функции печени, такие как необъяснимая тошнота, анорексия, чувство усталости. В случае, когда активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT) в сыворотке стойко превышают верхнюю границу нормы в 3 раза и более, применение препарата Тизанидин-СЗ следует прекратить.

Контрацепция

Следует информировать пациенток с сохраненным репродуктивным потенциалом о неблагоприятном влиянии препарата на развивающийся плод, выявленном в исследованиях у животных. Во время применения препарата, а также в течение 1 суток после прекращения приема препарата пациенткам с сохраненным репродуктивным потенциалом следует использовать надежные способы контрацепции (при правильном и длительном использовании которых частота наступления беременности составляет < 1 %).

Влияние на способность управлять транспортными средствами и механизмами:

Пациентам, у которых на фоне применения препарата отмечается сонливость, головокружение или какие-либо признаки артериальной гипотензии следует рекомендовать воздержаться от видов деятельности, требующих высокой концентрации внимания и быстрой реакции, например, управления транспортными средствами и механизмами.

Форма выпуска/дозировка:

Таблетки 2 мг и 4 мг.

Упаковка:

По 10 таблеток в упаковку ячейковую контурную из пленки ПВХ и фольги алюминиевой.

По 30 таблеток в банки полимерные типа БП из полиэтилена низкого давления с крышками из полиэтилена высокого давления или во флаконы полимерные из полиэтилена низкого давления с крышками из полиэтилена высокого давления.

Каждую банку, флакон, 2, 3, 5 упаковок ячейковых контурных вместе с инструкцией по применению помещают в пачку картонную.

Условия хранения:

В защищенном от света месте, при температуре не выше 25 °С.

Хранить в недоступном для детей месте.

Срок годности:

3 года.

Не применять по истечении срока годности, указанного на упаковке.

Условия отпуска

По рецепту

Производитель

Непубличное акционерное общество «Северная звезда» (НАО «Северная звезда»), Ленинградская обл., Всеволожский муниципальный район, Кузьмоловское городское поселение, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 4, Россия

Владелец регистрационного удостоверения/организация, принимающая претензии потребителей:

НАО «Северная звезда»

Комментарии

(видны только специалистам, верифицированным редакцией МЕДИ РУ)

Специализированные пищевые продукты диетического лечебного питания Энергетические модули «Тимидин» и «Дезоксицитидин» торговой марки «ОРФАНИК»®

Первые в Российской Федерации зарегистрированные продукты лечебного питания для диетотерапии пациентов с диагнозом митохондриальная миопатия и синдромами, сопровождающимися недостаточностью тимидина и дезоксицитидина.

• Показаны для применения детей с 1 месяца жизни и взрослым в составе специализированных диет.
• Продукты выпускаются в быстродиспергируемых таблетках для приготовления напитка и в порошке.
• Высокоэнергетические составы модулей ориентированы на быструю выработку энергии и доставку элементов метаболизма на клеточный уровень.
• Срок годности: 24 месяца от даты изготовления.
• Производится в Российской Федерации.

Состав: дезоксицитидин/тимидин, пищевые волокна, мальтодекстрин, антислеживающий агент. Содержание нуклеозидов в порции (1 таблетка) 400 мг – соответствует количеству, рекомендованному на основании научных публикаций и результатов клинических апробаций. Не содержит белков и жиров.

Клинические исследования проводились в ведущем медицинском учреждении Российской Федерации — ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России.

Свидетельства о государственной регистрации № AM.01.07.01.007.R.000370.04.23 от 06.04.2023 г. и № AM.01.01.01.004.R.000416.06.23 от 02.06.2023 г.

Информация для специалистов

Митохондриальная миопатия

Этиология и патогенез:
Синдром истощения или деплеции митохондриальной ДНК (мтДНК) – это генетически и клинически гетерогенная группа аутосомно-рецессивных заболеваний, которая характеризуется резким снижением содержания мтДНК, что ведет к нарушению образования энергии в клетках и, как следствие, к поражению тканей и органов.

Митохондриальная миопатия – первое описанное заболевание, связанное с истощением мтДНК, которое обусловлено мутацией в гене тимидинкиназы 2. Тимидинкиназа 2 (ТК2) — это кодируемый ядерной ДНК митохондриальный фермент, катализирующий превращения нуклеозидов тимидина и дезоксицитидина в нуклеозид-монофосфат. Нуклеозид-монофосфат фосфорилируется с образованием дезоксинуклеозидтрифосфата (дНТФ), необходимым для репликации и поддержания мтДНК, так как он является субстратом для гамма полимеразы, которая в свою очередь регулирует количество копий мтДНК. Запас дНТФ поддерживается либо их транспортом из цитоплазмы, где они синтезируются, либо путем реутилизации дезоксинуклеозидов в матриксе митохондрий, причем доля использования того или иного пути различна в пролиферирующих и непролиферирующих клетках. ТК2 — ключевой фермент пути реутилизации.

Диагностика:
При биохимических методах диагностики обнаружения небольших повышений креатинфосфокиназы (норма КФК для детей не более 280 Ед/л) и лактата (норма не более 2,2 ммоль/л), служат основанием для постановки предварительного диагноза.
Однако из-за схожести клинико-параклинических характеристик больных с мутациями гена ТК2 и больных с другими нервно-мышечными заболеваниями, в том числе таким частым, как спинальная мышечная атрофия с мутациями в гене SMN1 (СМА-5q), для подтверждения диагноза необходимо проведение ДНК-анализа.
При ДНК-исследованиях используют методы прямого секвенирования гена TK2 или таргетные NGS-панели. Описано более 45 различных мутаций в гене ТК2, по данным базы Human Gene Mutation Database (HGMD) и ClinVar, большинство из которых миссенс-замены.

Клинические проявления:
У больных митохондриальной миопатией активность ТК2 в мышечных митохондриях может быть снижена до 14-45% от среднего значения, установленного у здоровых контрольных лиц. Заболевание может иметь тяжелое и легкое течение. При любой форме встречаются частые респираторные инфекции, а основной причиной смерти является развитие дыхательной недостаточности.

Основные формы ТК2- ассоциированной миопатии	Доля	Возраст дебюта	Характеристика
I. Инфантильная форма	~40%	Дети до 1 года	Ранний дебют, быстрое прогрессирование симптомов и летальный исход в раннем возрасте от дыхательной недостаточности. Описано сочетание миопатии с энцефалопатией, лиссэнцефалией, эпилептическими приступами, лицевой диплегией, дисфагией и множественными переломами.
II. Ювенильная/ детская форма	~40%	Дети 1-12 лет	Умеренно или быстро прогрессирующее течение. Часто пациентам ставят диагноз спинальной мышечной атрофии III типа. В первую очередь поражается проксимальная мускулатура. Описаны случаи лицевой диплегии, птоза, наружной офтальмоплегии, дисфагии, единичные случаи потери слуха, интеллектуальной недостаточности, энцефалопатии, синдрома удлиненного QT, аритмии, множественных переломов, туболопатии и гинекомастии.
III. С поздним началом/ взрослая форма	~20%	Дети старше 12 лет и взрослые	В клинической картине преобладает слабость лицевой мускулатуры (лицевая диплегия) в сочетании с мышечной слабостью проксимальных отделов конечностей. По мере прогрессирования может развиться дыхательная недостаточность, наружная офтальмоплегия, дисфагия, дизартрия, периферическая нейропатия, потеря слуха. Большинство не утрачивает способности к самостоятельной ходьбе.

Лечение:

Пациенты с подтвержденным дефицитом ТК2 имеют сниженный уровень нуклеотида дезокситимидин-монофосфата для синтеза мтДНК, что до недавнего времени приводило к инвалидизации и смерти, так как пациентам могла быть оказана только симптоматическая терапия. Однако в 2019 году появилось первое доклиническое исследование об эффективности применения дезоксинуклеозидов: дезокситимидина и дезоксицитидина. Терапия оказала значительный положительный эффект: повышение мышечной силы, уменьшение зависимости от респираторной поддержки, в некоторых случаях возобновлялась способность ходить; при этом не было зарегистрировано ни одного серьезного нежелательного явления, связанного с терапией.

В связи с высокой эффективностью терапии пациентам показано потребление продукта с дезокситимидином (тимидином) и дезоксицитидином или специализированная диета, обогащенная тимидином и дезоксицитидином, которые являются предшественниками нуклеотидов, с расчетом на то, что клетки смогут производить дополнительную мтДНК. Это, в свою очередь, может помочь уменьшить клинические симптомы.

Статья на конкурс «био/мол/текст»: История о том, как мы пошли туда, не знаю куда, чтобы найти то, не знаю что. Если вы думаете, что видите то, что видите, и уверены, что исследуете то, что исследуете — проверьте еще раз, а потом еще раз. На примере нашего почти детективного исследования и поиска неизвестно чего можно увидеть, как важно выбрать правильную стратегию исследования, использовать подходящие методы и подвергать сомнению результаты. Ведь зачастую мы просто забываем о возможности получения каких-то артефактов — мы же строим свои гипотезы на базе опубликованных и проверенных данных. Даже если вы обложились самой лучшей литературой и имеете доступ к самому современному оборудованию, результат, к сожалению, не гарантирован. Для успеха научного эксперимента важны еще и не совсем научные составляющие: это они — везение, капелька удачи, стечение обстоятельств — иногда приводят к весьма неожиданным результатам.

Введение

История эта началась довольно давно, правда, и закончилась уже не вчера. Во время выполнения всяких экспериментов для моей диссертации, связанной с туберкулезом, мне было нужно оценивать пролиферацию Т-лимфоцитов. Изучали мы тогда взаимодействие макрофагов и нейтрофилов, фагоцитирующих, то есть поглощающих, микобактерии (возбудители туберкулеза), со специфичными к микобактериальным антигенам Т-лимфоцитами.

Макрофаги и Т-лимфоциты — клетки, играющие основную роль в противотуберкулезном иммунитете. Макрофаги фагоцитируют бактерии, что приводит к запуску механизмов активации врожденного иммунитета. А кроме того, макрофаги презентируют на своей поверхности в составе специальных молекул (молекул главного комплекса гистосовместимости МНСII) фрагменты микобактерий (антигены) Т-лимфоцитам, что приводит к их активации и запуску адаптивного звена иммунной системы [1]. Стимулированные Т-лимфоциты, в свою очередь, активируют макрофаги, чтобы те убивали поглощенные бактерии.

Нейтрофилы — клетки врожденного иммунитета, одними из первых мигрирующие в область воспаления. Они активно фагоцитируют микобактерии, но не способны эффективно их убивать и активировать Т-клетки, то есть их нельзя отнести к профессиональным антиген-презентирующим клеткам (АПК). Таким образом, нейтрофилы выступают в качестве «троянского коня», экранируя бактерии от профессиональных АПК, макрофагов и дендритных клеток, и при этом производят различные факторы, провоцирующие излишнее воспаление. Наша лаборатория в числе прочих занималась этими вопросами и одной из первых опубликовала данные о негативной роли нейтрофилов в туберкулезе [2].

Сейчас биологи активно изучают взаимодействие врожденной и приобретенной систем иммунитета, в том числе взаимодействие макрофагов, нейтрофилов и Т-лимфоцитов. В частности, исследователей интересуют различия в активации Т-лимфоцитов макрофагами, поглотившими непосредственно бактерии, и макрофагами, поглотившими нейтрофилы с бактериями внутри.

Тем, кто занимается иммунологией, хорошо известно, что оценивать активность Т-лимфоцитов можно по их способности пролиферировать (делиться) в ответ на различные стимулы. Одним из быстрых, удобных и доступных в нашей лаборатории способов оценки пролиферации клеток было определение включения ³[H]тимидина в реплицирующуюся ДНК. Метод очень прост: в культуру анализируемых клеток добавляют ³[H]тимидин — меченый тритием тимидин, один из четырех нуклеозидов, входящих в состав ДНК. Следовательно, если клетки делятся, этому предшествует репликация ДНК — синтез новых цепей ДНК на основе уже имеющихся в клетке. Если синтезируется новая ДНК, то меченый тимидин будет в неё включаться наравне с немечеными нуклеозидами. Остается лишь измерить интенсивность включения метки счетчиком радиоактивности. Несмотря на то, что этот метод довольно старый, он очень прост и до сих пор довольно широко применяется во всём мире.

В процессе наших изысканий мы заметили: если в смешанной культуре клеток присутствуют нейтрофилы — с бактериями внутри или без них, — включение ³[H]тимидина, а значит, как мы думали, и пролиферация Т-лимфоцитов сильно снижается (рис. 1). В некоторых случаях — почти на 90%, что, безусловно, нас очень заинтересовало.

Материалы, много методов и никакого результата

Конечно, сразу встал вопрос, что же это за компонент, приводящий к практически полному прекращению пролиферации Т-клеток. На первый взгляд всё казалось довольно простым: прошерсти литературу, оцени экспрессию генов в нейтрофилах, определи концентрацию известных супрессоров Т-клеточной пролиферации, попробуй их заблокировать, глядишь и найдешь что… А если не найдешь, тогда другой путь ждет тебя, более извилистый. Так мы, конечно, и сделали, но… ничего не нашли.

Первым делом мы проверили в системе Transwell (там клетки физически изолированы друг от друга мембраной, проницаемой только для молекул), необходим ли для подобного действия контакт нейтрофилов с Т-лимфоцитами или же нейтрофилы просто выделяют некий растворимый фактор. Убедились, что это нечто растворимое.

Затем мы выяснили, что в нашем случае к подавлению Т-клеточной пролиферации не причастны самые известные супрессоры — IL-10, TGF-b, аргиназа и простагландины, обнаруженные в супернатанте (надосадочной жидкости) нейтрофилов. Кроме того, оказалось, что это «нечто» довольно стабильное. Его можно перезамораживать по нескольку раз, кипятить, в воде оно не горит, в огне не тонет — вообще ничего не меняется: это «нечто» по-прежнему прекрасно подавляет включение метки в ДНК специфических Т-лимфоцитов.

На следующем этапе мы решили проверить, ограничивается ли это явление только специфическими к микобактериальным антигенам Т-лимфоцитами или же оно гораздо шире. Для этого стимулировали Т-лимфоциты неспецифически, через ко-рецептор CD3, и с помощью конканавалина А, через лектиновые рецепторы. Результат был тот же.

Наконец мы взяли миелому и испробовали неизвестное вещество на ней. И когда мы увидели, что и миелома не включает тимидин при добавлении этого «нечто»… Ну, думаю, Нобелевская, не меньше! Стало понятно, что всё это лежит уже вне области туберкулеза, но хочется же найти ответ на мучающий вопрос. Тогда как определить это «нечто»? А главное, стоит ли вообще за это браться, ведь дальнейшие действия, скорее всего, будут вне нашей компетенции…

Итак, стратегия, вроде бы, опять вполне понятна: раздели́ полученный от нейтрофилов супернатант на фракции, как-то определи массу, элементный состав и структуру искомого вещества — и получишь ответ. Но, как обычно, путь исследователя тернист и извилист. То, что умещается в описании в несколько строк, в реальности растягивается на годы.

И вот, стала я искать, кто бы мне разделил этот супернатант на составляющие. Сначала всё выглядело как-то безрадостно: я застряла, подходящих людей найти не могла. Ведь человек должен быть знающий и умеющий, не занятый по горло своими интересами и почему-то готовый погрузиться в твою проблему и осуществить твои желания. И как обычно, в разговорах, вдруг выяснилось, что у коллег есть знакомый, в полной мере владеющий методами HPLC (high performance liquid chromatography). И вот еду я со своей пробиркой, надеясь на чудо. Первый же личный контакт почему-то вызывает интерес к моей проблеме, и человек решается мне помочь. И помогает. И притом совершено бесплатно, то есть даром. Супернатант разделили.

Как сейчас помню, стою я у счетчика радиоактивности и жду заветных цифр — и вот они! Адреналин, сердце стучит, получилось! А что, собственно, получилось? Да просто всё как-то сдвинулось с мертвой точки: только одна из полученных фракций подавляла включение метки. В этот момент ощущаешь прилив счастья и осознание, что ты занимаешься тем, что тебе действительно нравится. Итак, наше плодотворное сотрудничество привело к тому, что после нескольких последовательных разделений вычленилась фракция, содержащая монокомпонент, добавление которого ингибировало включение тимидина в активированные Т-лимфоциты. Но по-прежнему было неясно, что это?

На каком-то очередном сборище, школе/конференции, я разговорилась с одним физиком, который сказал, что они как раз занимаются определением элементного состава веществ и, возможно, смогут мне помочь. Договорились списаться, чтобы подробнее это обсудить. И вот я получаю письмо, подтверждающее, что они могут это сделать, но для анализа им необходимо 10 мг этого «нечто». Тут я призадумалась… Непосвященному читателю может показаться, что это ерунда: ну что такое 10 мг — и не заметишь! Но тут нужно пояснить, как мы получали это неизвестное вещество. Оно секретируется нейтрофилами мышей, и чтобы его получить, мышам нужно внутрибрюшинно ввести, например, пептон: он вызывает неспецифическое воспаление и мощный приток нейтрофилов в область введения. Затем нужно выделить нейтрофилы из брюшной полости (от одной мыши можно добыть 15–20 млн клеток), поместить их в культуру in vitro и через 24 часа собрать супернатант, содержащий много всего помимо того самого «нечто». Затем надо разделить супернатант с помощью HPLC, сконцентрировать или высушить нужную фракцию и тогда уже отдавать на определение.

Я начала считать, сколько килограммов мышей мне нужно и сколько литров супернатанта потребуется прогнать через хроматографические колонки, чтобы получить заветные 10 мг. Это казалось совершенно нереальным.

Параллельно я нашла несколько мест, где попытались определить массу моего «нечто» с помощью масс-спектрометрии. Единственное, что я знала на тот момент о размере этого вещества, — то, что оно меньше 10 кДа. Это мы определили с помощью диализа, но, к сожалению, диализных мешков с меньшим диаметром пор в ближайшем окружении не нашлось. Метод очень прост: помещаешь интересующий раствор в диализный мешок с определенного размера порами, а мешок — в соответствующую среду в большем объеме. Если молекулы искомого вещества меньше диаметра пор, то оно выйдет наружу.

Результаты масс-спектрометрии, несмотря на предполагаемую высокую точность метода, были довольно противоречивыми. В одном месте мне определили, что это вовсе не монокомпонент, а два компонента массой примерно 3 кДа и 7 кДа. В другом месте мне сказали, что образец имеет массу 1 кДа. В третьем определили чрезвычайно интересную структуру, но когда я приехала за результатом и стала внимательно изучать диаграмму, выданную масс-спектрометром, мы с оператором прибора пришли к выводу, что это спектр частички пластика, случайно попавшей в эппендорф, видимо, при вакуумной сушке образца. И наконец, коммерческое предприятие, предлагающее услуги по определению элементного состава веществ, на деле расписалось в своем бессилии. Надо признать, что всё это ввергало меня в уныние. Я понимала, что лезть и заниматься чем-то совершенно не из своей области непросто — как говорится, не суйся в воду, не зная броду. Но внутри всё же надеешься, что что-то как-то где-то сложится. В очередной раз меня посетила мысль: «А не бросить ли всё это?..»

В своем повествовании я почти случайно упустила важный факт. Каждый раз при проверке действия вещества на пролиферирующие Т-лимфоциты я, конечно же, смотрела в микроскоп на культуру клеток. Делящиеся Т-лимфоциты от неделящихся, как правило, можно отличить на глаз: при делении Т-лимфоциты образуют кластеры, то есть собираются в кучки, а покоящиеся клетки равномерно распределены на дне лунки планшета. Так вот, ко всем имеющимся загадкам добавлялась еще одна: на глаз всё выглядело одинаково — как будто все клетки делятся. Закрадывалось подозрение, что всё не совсем так, как мы думаем.

Чтобы развеять сомнения мы оценили пролиферацию двумя способами одновременно: по включению ³[Н]тимидина и с помощью CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester), проникающего в клетку и ковалентно связывающегося с различными макромолекулами. Оказалось, что Т-клетки прекрасно делятся, но меченый тимидин по-прежнему не включают. Так стало понятно, что речь уже идет не о блокировке пролиферации, а о блокировке включения тимидина в ДНК Т-лимфоцитов. Это немного меняло постановку задач и ход размышлений, зачем природе это нужно, но совершенно не облегчало определения «нечто». Мысль просто забыть о нём посещала меня всё чаще…

Что из этого всё-таки вышло? Результат, наконец

В это же время я собиралась ехать в Штаты поучиться гистологии, иммуногистохимии и всему, чему придется. В обсуждении предварительных планов на работу я, естественно, упомянула, что у меня есть некое загадочное вещество, которое никак не удается определить. И решила взять его с собой на случай, если кто-то захочет мне помочь. Поскольку оно довольно стабильное, проблем с перевозкой возникнуть не должно было. И вот оно вместе со мной полетело к Ниагаре. С легкой руки моего волшебного наставника «нечто» получило имя «змеиное масло» и теперь хранилось в холодильнике Roswell Park Cancer Institute. Мы попробовали его действие на других клетках, посмотрели, что при этом происходит с клеточным циклом, обнаружили небольшие изменения в одной из фаз, но не принципиальные. В это же время туда приехал один замечательный химик, который на одном из «перекуров» почему-то согласился взять образец и отдать его на анализ. Таким образом «змеиное масло» потекло с севера на юг, в Сан-Диего, и, к счастью, никто не разлил его. Командировка моя подходила к концу. Приобрела я там много, и в основном не материального, что хранится гораздо дольше.

Время шло, другие проекты как-то продвигались, и в один прекрасный день я получила письмо с отчетом о проведенном анализе. За какие-то 70 долларов, которые так никто с нас и не взял, ребята из солнечного Сан-Диего определили, что «змеиное масло» имеет массу 242 Да и что в его составе точно есть водород. Не очень обнадеживающе, но всё же… На остальное определение, к сожалению, вещества не хватило. Тем не менее это был очередной шаг на пути преодоления.

Попытки биться во все встречающиеся двери и окна привели к нашим коллабораторам, занимающимся ЯМР. В очередной раз я услышала, сколько нужно вещества, чтобы его качественно проанализировать. Теперь было необходимо 2 мг, что, конечно, не 10, но тоже прилично. Договорились, что я сконцентрирую всё добытое «змеиное масло», высушу и привезу его для анализа — вдруг что-то получится. В очередной раз я отвезла пробирку, практически ни на что не надеясь, и уехала в отпуск гулять по горам Гармиш-Партенкирхена.

И вот в одно прекрасное утро я открываю почту и вижу письмо, которое, как не сложно догадаться, содержит две новости: одну хорошую и одну плохую. «Змеиное масло» расшифровано, и это не может не радовать. Тут глаза начинают перескакивать с первых строчек письма на последние, чтобы поскорей узнать результат, но одновременно хочется и оттянуть этот момент. Как будто читаешь детектив и дошел до страницы с разгадкой — и глаз бегает по странице в поисках имени, и летят мысли: «Нет-нет-нет, он не может быть убийцей… нет-нет-нет, это не может быть нашей разгадкой… это “нечто”, это “змеиное масло” — что?! Самый обыкновенный тимидин?! Самый обыкновенный?!» То есть меченый тимидин не включался в синтезирующуюся ДНК просто потому, что в растворе был избыток обычного, немеченого тимидина, который по какой-то неведомой причине активно выделяют нейтрофилы, никак не влияя на пролиферацию Т-клеток? Ну да, получается, что так (рис. 2) [3]. В этот момент показалось, что всё было так просто и очевидно, но эта мудрая мысль почему-то раньше не приходила в голову. Нобелевская не состоялась, и Cell с Science будут по-прежнему как-то обходиться без меня… Стало немного грустно, но и легко одновременно — как раз для прогулки в горах.

Выводы. В основном очевидные

Полученные данные можно интерпретировать по-разному. Пока нет ответа на вопрос, почему и для чего нейтрофилы выделяют большие количества тимидина. Впервые подобную информацию опубликовали около 40 лет назад, а затем спустя 30 лет. Было показано, что макрофаги [4] и некоторые виды миелом [5] тоже способны по неизвестным причинам выделять тимидин. Вместе с тем, для некоторых видов опухолей тимидин просто токсичен. В клеточной биологии тимидин используют для синхронизации клеточного цикла in vitro. Может ли выделяемый нейтрофилами тимидин играть подобную роль in vivo — не известно. Возможно, секреция тимидина нейтрофилами как-то связана с их способностью делать знаменитые ловушки — NETs (neutrophil extracellular traps), в состав которых входит ДНК [6]. Однако остается неясным, секретируют ли нейтрофилы другие виды нуклеозидов.

Возможно, эта история не совсем научно-популярная, а больше популярно-научная, но она приводит к важным выводам. У нас есть стереотипы. В голове иммунолога сидит формула «включение тимидина = пролиферация», которая, как показывает пройденный нами путь, не всегда справедлива. Наверняка аналогичных ситуаций довольно много встречается в разных областях науки. Далеко не всегда четко определяется причинно-следственная связь. Поэтому проверяй себя разными доступными способами, чтобы быть уверенным в получаемых результатах. И наконец, последний и самый важный вывод. Среди нас действительно много замечательных людей и специалистов, готовых помогать на разных уровнях, — нужно только правильно искать. Нетворкинг — вещь очень важная. Оставаясь в тени или даже в темноте, сложнее найти верный путь. Нужно ли заниматься делом, в котором ты не специалист? Скорее всего, нет. Но если очень хочется и есть время и силы, то, конечно, можно — может, вам и повезет. Дорогу осилит идущий.

May the force be with you!

1. Anne O’Garra, Paul S. Redford, Finlay W. McNab, Chloe I. Bloom, Robert J. Wilkinson, Matthew P.R. Berry. (2013). The Immune Response in Tuberculosis. Annu. Rev. Immunol.. 31, 475-527;
2. E. B. Eruslanov, I. V. Lyadova, T. K. Kondratieva, K. B. Majorov, I. V. Scheglov, et. al.. (2005). Neutrophil Responses to Mycobacterium tuberculosis Infection in Genetically Susceptible and Resistant Mice. Infection and Immunity. 73, 1744-1753;
3. I. A. Linge, E. V. Kondratieva, T. K. Kondratieva, V. A. Makarov, V. I. Polshakov, et. al.. (2016). “Suppressor factor” of neutrophils: A short story of a long-term misconception. Biochemistry Moscow. 81, 1284-1292;
4. Stadecker M.J., Calderon J., Karnovsky M.L., Unanue E.R. (1977). Synthesis and release of thymidine by macrophages. J. Immunol. 119, 1738–1743;
5. Bjørn Spilsberg, Frode Rise, Dirk Petersen, Jon Nissen-Meyer. (2006). Thymidine secretion by hybridoma and myeloma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 342, 221-226;
6. Volker Brinkmann. (2018). Neutrophil Extracellular Traps in the Second Decade. J Innate Immun. 1-8;
7. Иммунитет: борьба с чужими и… своими.